摘 要：腐植酸被認為在動物喂飼試驗中對健康和產(chǎn)率具有整體積極作用，同時頗有爭議的是，其也被作為腫瘤的病原學因素之一。我們嘗試評價斯洛伐克地區(qū)特定來源腐植酸在使用推薦預防劑量時的體外作用。研究其體外的抗氧化性質(zhì)、對肝線粒體中酶系和非酶系抗氧化防御系統(tǒng)的作用以及對人工培養(yǎng)腫瘤細胞株的作用。我們觀察到不論腐植酸是溶解于二甲基亞砜(DMSO)或是直接加入呼吸介質(zhì)中線粒體懸浮液，在腐植酸給藥后超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著下降。所測定的其他抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)，其活性及還原型谷胱甘肽(G S H)的含量與對照組相比并未表現(xiàn)出顯著變化。腐植酸對超氧陰離子自由基(O2-·)的抑制率低于其對羥自由基(·O H)的抑制率。6種不同腫瘤細胞株的存活率顯示出只有急性T淋巴性白血病細胞株對測試腐

　　植酸敏感。盡管在水溶液中溶解度相對較低，但特定來源腐植酸參與了氧化還原調(diào)控。通過奪取自由基，腐植酸重置了抗氧化防御機制。來源于自然資源的腐植酸體外研究結(jié)果顯示出其作為有前景的免疫增強劑的潛力。

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　　關鍵詞：腐植酸 線粒體 抗氧化酶 谷胱甘肽 細胞培養(yǎng)

　　中圖分類號：TQ314.1 文獻標識碼：A 文章編號：1671-9212(2013)02-0032-06

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　　Effects of humic acids in vitro

　　Janka Va?ková1, Beáta Velik1, Martina Pilátová2, Ivan Kron1, Ladislav Va?ko1 write

　　He Jing3, Ding Yafang3, Yang Jing3, Li Baocai3 translate

　　(1 Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, Pavol Jozef

　　?afárik University in Ko?ice, Ko?ice, 104011

　　2 Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Pavol Jozef ?afárik University in Ko?ice, Ko?ice, 104011

　　3 Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500)

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　　Abstract: Humic acids are known for their overall positive health and productivity effects in animal feeding trials and,controversially, as an aetiological factor of cancer. We tried to assess the in vitro effect of humic acids from a selected source in Slovakia when used at recommended prophylactic dosage. We investigated antioxidant properties, enzymatic

　　and non-enzymatic antioxidant defence system in liver mitochondria and cultured cancer cell lines in vitro. We observed a significant decrease in superoxide dismutase activity after humic acids treatment irrespective of dissolving in dimethyl sulphoxide or direct addition to mitochondria suspension in a respiration medium. Activities of other antioxidant enzymes

　　measured, such as glutathione peroxidase and glutathione reductase, showed no significant differences from the control as well as the reduced glutathione content. Percentage of inhibition by humic acids of superoxide radical indicated lower efficacy compared with that of hydroxyl radical. Survival of six different cancer cells lines indicated that only the acute T lymphoblastic leukaemia cell line was sensitive to the tested humic acids. Despite relatively low solubilityin aqueous solutions, humic acids from the selected source participated in redox regulation. By recapturing the radicals,humic acids reloaded the antioxidant defensive mechanism. Results from in vitro study conducted with humic acids from the natural

　　source showed potential of these substances as promising immunity enhancing agents.

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　　Key words: humic acid; mitochondria; antioxidant enzyme; glutathione; cell culture.

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　　腐植酸是具有多元羧酸側(cè)鏈，多芳環(huán)和雜環(huán)的結(jié)構(gòu)復雜高分子芳香聚合物，為土壤和褐煤中天然降解的有機成分，來自被土壤菌降解的腐植物質(zhì)。此外，腐植酸為于中性或堿性p H可溶，且具有化學活性的有機分子。腐植酸鹽是腐植酸的陰/陽離子交換位點為Ca2+，Na+，Al3+和Fe2+而非氫的腐植酸鹽類。長久以來，腐植酸被用于種植業(yè)領域中的生長刺激劑。在歐洲是用于預防及獸醫(yī)治療藥物的活性物質(zhì)。作為止瀉劑、鎮(zhèn)痛劑、免疫刺激劑和抗菌劑給藥，并被用作替代治療物質(zhì)以提高飼料轉(zhuǎn)化率和治療營養(yǎng)不良及腹瀉。盡管較多試驗研究已顯示腐植酸很大程度上是無毒和非致畸性的，但其也被認為是東亞特定病區(qū)兒童及青少年關節(jié)和生長板病變的大骨節(jié)病病因。從動物喂飼試驗可知，腐植酸鹽對動物健康及產(chǎn)率具有積極作用。腐植酸的體內(nèi)或體外作用機制均尚不清楚。據(jù)觀察，腐植酸作用于內(nèi)皮細胞可直接增加其C a2+滲透性，增加N O/過氧硝酸鹽的生成，并可能導致凋亡細胞死亡。通過氧化生成和減少人紅細胞中抗氧化酶活性，腐植酸誘導棘紅細胞轉(zhuǎn)化和人外周血液淋巴細胞D N A氧化損傷。腐植酸還可以刺激大鼠肝線粒體呼吸作用。腐植酸分子結(jié)構(gòu)與輔酶Q具有一些相似性，這意味著腐植酸可能干擾線粒體氧化還原系統(tǒng)。線粒體被公認為是超氧陰離子和過氧化氫的一個有效來源，甚至是在正常狀態(tài)下。我們的目標是評價抗氧化性質(zhì)和腐植酸對主要代謝器官線粒體酶系和非酶系抗氧化活性的作用，從而評估腐植酸的潛在毒性影響，以及在推薦預防劑量時對體外培養(yǎng)腫瘤細胞株的作用。

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　　1 材料與方法

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　　如未指定，使用的所有化學藥品均為分析級。溶液采用雙蒸水現(xiàn)配。腐植酸購自Humac Natur(Humac Ltd.，科西策，斯洛伐克)。腐植酸初含量為10mg/10mL[10%DMSO或磷酸鹽緩沖液(PBS)pH 7.4]。然而，腐植酸的溶解度低;因此，將腐植酸溶液超聲兩次10min。過濾后，濾紙干燥至恒重，稱重并提取，所測溶液中腐植酸余量為DMSO中6.4 mg/10mL(3次)，PBS中3.2 mg/10 mL。

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　　選用雄性Wistar大鼠(Velaz，布拉格，捷克共和國)，體重200～250 g。根據(jù)科西策大學動物護理和使用委員會批準的規(guī)程，動物處死方法為頸椎脫位和斷頭處死。

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　　肝線粒體采用Johnson和Lardy(1967)的分離方法從雄性Wistar大鼠中分離獲得。線粒體蛋白含量測定使用Bradford(1976)蛋白質(zhì)測定法。

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　　谷胱甘肽還原酶(GR;E.C.1.6.4.2)活性根據(jù)Carlberg和Mannervik(1985)的方法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx;E.C.1.11.1.9)活性采用Flohe和Gunzler(1984)的方法，超氧化物歧化酶(SOD;E.C.1.15.1.1)活性按試劑盒說明書(Fluka，日本東京)進行。腐植酸給藥的線粒體中還原型谷胱甘肽(GSH)含量使用Ellmans試劑(R2=0.991)通過Floreani等的改良方法測定。

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　　腐植酸的抗氧化性質(zhì)采用Beauchamp和Fridovich(1971)的方法評價。